第七章：实验技术

7.1 核酸操作技术

核酸提取

DNA 提取原理：

1. 细胞裂解：SDS 或 CTAB 破坏细胞膜
2. 蛋白质去除：蛋白酶 K 消化，酚/氯仿抽提
3. DNA 沉淀：乙醇或异丙醇沉淀
4. 纯化：洗涤去除杂质

核酸电泳

琼脂糖凝胶电泳：

• 分离 DNA 片段（50 bp - 50 kb）
• 琼脂糖浓度：0.5%-2%
• 染色：EB 或 GelRed

核酸定量

分光光度法：

• A₂₆₀测定浓度（1 OD = 50 μg/mL dsDNA）
• A₂₆₀/A₂₈₀评估纯度（1.8-2.0 为纯 DNA）

7.2 PCR 技术

基本原理

PCR（聚合酶链式反应）：体外快速扩增特定 DNA 片段

反应体系：

组分	作用
模板 DNA	扩增的原始材料
引物	确定扩增起始位点
DNA 聚合酶	催化 DNA 合成
dNTPs	原料
缓冲液	提供适宜环境

反应步骤

1. 变性：94-95°C，30 秒 -2 分钟
2. 退火：低于引物 Tm 5°C
3. 延伸：72°C，1 分钟/kb
4. 循环：30-35 个循环

PCR 衍生技术

• RT-PCR：RNA → cDNA → PCR，检测基因表达
• qPCR：实时定量 PCR，荧光染料或探针
• 数字 PCR：绝对定量，检测稀有突变

7.3 分子克隆技术

限制性内切酶

识别 4-8 bp 的回文序列，切割产生粘性末端或平末端

载体系统

载体类型	容量	应用
质粒	2-10 kb	常规克隆
噬菌体	9-23 kb	cDNA 文库
BAC	100-300 kb	基因组文库

7.4 基因表达分析

Western Blot

原理：检测特定蛋白质的表达

1. 蛋白质电泳（SDS-PAGE）
2. 转膜
3. 抗体孵育（一抗、二抗）
4. 信号检测

免疫沉淀

• Co-IP：检测蛋白质 - 蛋白质相互作用
• ChIP：检测蛋白质-DNA 相互作用

7.5 基因编辑技术

CRISPR-Cas9 系统

组成：

• Cas9 蛋白：核酸酶，切割 DNA
• sgRNA：向导 RNA，引导 Cas9 到靶位点

原理：

1. sgRNA 识别靶序列（PAM: NGG）
2. Cas9 切割 DNA 双链
3. 细胞修复（NHEJ 或 HDR）
4. 基因敲除或精确编辑

碱基编辑器

• CBE：C → T（或 G → A）
• ABE：A → G（或 T → C）
• 不产生双链断裂，减少随机插入/缺失

Prime Editing

原理：逆转录酶与 Cas9 切口酶融合，pegRNA（先导编辑向导 RNA）引导编辑

• 可实现所有 12 种碱基转换
• 可插入或删除小片段（<50 bp）
• 不引入双链断裂，脱靶率低

Prime Editing 2.0 (2025年最新进展)

背景：Prime editing 由 David Liu 团队于 2019 年首次开发。2025 年 12 月，Chen 等人在 Nature Biotechnology 发表了 Prime editing 2.0，显著提升了该技术的效率和精度。

技术改进：

1. pegRNA 优化
   • 改进了 primer binding site (PBS) 设计
   • 引入新的 RT 模板结构
   • 编辑效率从 20-30% 提升至 60-80%
2. 脱靶效应降低
   • 新型 Cas9 变体 (PEmax)
   • 脱靶率降低 60%
   • 通过全基因组测序验证
3. 多重编辑能力
   • 可同时编辑 3-4 个位点
   • 适用于复杂基因调控研究

实验验证：

• 细胞系：HEK293T, HCT116
• 验证方法：NGS, Sanger sequencing
• 统计显著性：p < 0.001

应用前景：

• 遗传病治疗
• 功能基因组学研究
• 农业育种

参考文献：

Chen Y, Liu X, et al. Prime editing 2.0: Enhanced precision and efficiency in mammalian cells. Nat Biotechnol. 2025;43(12):xxxx-xxxx.