DNA提取原理：
RNA提取注意事项：
琼脂糖凝胶电泳：
聚丙烯酰胺凝胶电泳：
分光光度法：
荧光法：
（聚合酶链式反应）：体外快速扩增特定DNA片段
发明者：Kary Mullis（1993年诺贝尔化学奖）
反应体系： | 组分 | 作用 | |——|——| | 模板DNA | 扩增的原始材料 | | 引物 | 确定扩增起始位点 | | DNA聚合酶 | 催化DNA合成 | | dNTPs | 原料 | | 缓冲液 | 提供适宜环境（Mg²⁺、pH） |
94-95°C 变性 → 50-65°C 退火 → 72°C 延伸
↓
30-35个循环
↓
DNA指数扩增（2ⁿ）
关键参数：
逆转录PCR（RT-PCR）：
实时定量PCR（qPCR）：
数字PCR（dPCR）：
常用酶： | 酶 | 特点 | 应用 | |—-|——|——| | Taq酶 | 耐热，无校对 | 常规PCR | | Pfu酶 | 有3’-5’外切酶活性 | 克隆 | | Phusion酶 | 高保真，快速 | 测序、克隆 |
识别序列特点：
| 酶 | 识别序列 | 末端 |
|---|---|---|
| EcoRI | G↓AATTC | 5’粘性 |
| BamHI | G↓GATCC | 5’粘性 |
| HindIII | A↓AGCTT | 5’粘性 |
| SmaI | CCC↓GGG | 平末端 |
| 载体类型 | 容量 | 宿主 | 应用 |
|---|---|---|---|
| 质粒 | 2-10 kb | 细菌 | 常规克隆 |
| 噬菌体 | 9-23 kb | 细菌 | cDNA文库 |
| BAC | 100-300 kb | 细菌 | 基因组文库 |
| YAC | 0.5-2 Mb | 酵母 | 大片段克隆 |
目的基因获取 ← PCR/化学合成/文库筛选
↓
载体准备 ← 限制性内切酶切割
↓
连接反应 ← DNA连接酶
↓
转化/转染 ← 导入宿主细胞
↓
筛选鉴定 ← 抗生素抗性、蓝白斑筛选、测序
Gibson Assembly：
Golden Gate克隆：
原理：检测特定RNA的表达
步骤：
应用：
原理：检测特定蛋白质的表达
步骤：
应用：
Co-IP（免疫共沉淀）：
ChIP（染色质免疫沉淀）：
发现：Jennifer Doudna & Emmanuelle Charpentier（2020年诺贝尔化学奖）
组成：
：核酸酶，切割DNA
：向导RNA，引导Cas9到靶位点
原理：
sgRNA识别靶序列（PAM: NGG）
↓
Cas9切割DNA双链
↓
细胞修复（NHEJ或HDR）
↓
基因敲除或精确编辑
应用：
CBE（胞嘧啶碱基编辑器）：
ABE（腺嘌呤碱基编辑器）：
优势：
原理：
原代培养：直接从组织分离 传代细胞系：可无限传代（如HeLa、293T）
培养条件：
常用荧光染料： | 染料 | 激发/发射 | 应用 | |——|———-|——| | DAPI | 358/461 nm | DNA染色 | | GFP | 488/509 nm | 蛋白标记 | | RFP | 555/584 nm | 蛋白标记 |
共聚焦显微镜：
原理：
应用：