<〖<中心法则〗告诉我们，〖%DNA复制〗是遗传信息传递的基础。〖&PCR〗（聚合酶链式反应）技术正是模拟这一过程，在体外快速扩增特定〖@DNA〗片段。
发明者：〖>Kary Mullis 1983〗因此获得1993年诺贝尔化学奖。
| 组分 | 作用 | 示例 |
|---|---|---|
| 〖@模板DNA〗 | 扩增的原始材料 | 基因组DNA |
| 〖&引物〗 | 确定扩增起始位点 | 上下游各一条 |
| 〖#DNA聚合酶〗 | 催化DNA合成 | 〖#Taq酶〗 |
| 〖*dNTPs〗 | 原料 | dATP、dTTP、dGTP、dCTP |
| 〖=缓冲液〗 | 提供适宜环境 | 含〖!Mg²⁺〗、〖!pH 8.3〗 |
〖!94-95°C〗变性 → 〖!50-65°C〗退火 → 〖!72°C〗延伸
↓
30-35个循环
↓
DNA指数扩增（2ⁿ）
关键参数：
〖#Taq DNA聚合酶〗是从〖嗜热菌〗〖Thermus aquaticus〗中分离的：
高保真酶：如〖#Pfu酶〗、〖#Phusion酶〗，具有校对功能。
原理：〖&双脱氧终止法〗
DNA合成反应 + 少量双脱氧核苷酸（ddNTP）
↓
随机终止产生不同长度片段
↓
电泳分离，读取序列
特点：
| 平台 | 技术原理 | 读长 | 应用 |
|---|---|---|---|
| 〖&Illumina〗 | 桥式PCR + 荧光标记 | 150-300 bp | 全基因组、RNA-seq |
| 〖&Ion Torrent〗 | 半导体测序 | 200-400 bp | 靶向测序 |
| 〖&SOLiD〗 | 连接测序 | 50-75 bp | 重测序 |
Illumina测序流程：
PacBio（单分子实时测序）：
Oxford Nanopore：
| 载体类型 | 容量 | 宿主 | 应用 |
|---|---|---|---|
| 〖&质粒〗 | 2-10 kb | 细菌 | 常规克隆 |
| 〖&噬菌体〗 | 9-23 kb | 细菌 | cDNA文库 |
| 〖&BAC〗 | 100-300 kb | 细菌 | 基因组文库 |
| 〖&YAC〗 | 0.5-2 Mb | 酵母 | 大片段克隆 |
目的基因获取 ←〖&PCR〗/〖&化学合成〗/〖&文库筛选〗
↓
载体准备 ← 〖&限制性内切酶〗切割
↓
连接反应 ← 〖#DNA连接酶〗
↓
转化/转染 ← 导入宿主细胞
↓
筛选鉴定 ← 〖&抗生素抗性〗、〖&蓝白斑筛选〗
识别序列特点：
| 酶 | 识别序列 | 末端 |
|---|---|---|
| 〖&EcoRI〗 | G↓AATTC | 5’粘性 |
| 〖&BamHI〗 | G↓GATCC | 5’粘性 |
| 〖&HindIII〗 | A↓AGCTT | 5’粘性 |
| 〖&SmaI〗 | CCC↓GGG | 平末端 |
发现：〖>Jennifer Doudna & Emmanuelle Charpentier 2012〗，获2020年诺贝尔化学奖。
组成：
原理：
sgRNA识别靶序列（PAM: NGG）
↓
Cas9切割DNA双链
↓
细胞修复（NHEJ或HDR）
↓
基因敲除或精确编辑
应用：
CBE（胞嘧啶碱基编辑器）：C → T ABE（腺嘌呤碱基编辑器）：A → G
优势：不切断DNA双链，减少随机插入/缺失
原理：
RNA →〖&逆转录〗→ cDNA →〖&PCR〗→ 扩增产物
关键酶：〖#逆转录酶〗（如M-MLV、AMV）
应用：
机制：
应用：